грант Российского научного фонда, проект № 22-24-00913

Руководитель проекта: Ермаков О.А., канд. биол. наук, доцент, доцент кафедры «Зоология и экология»

Коллектив исполнителей: Иванов А.Ю., Луконина С.А.

Аннотация
Физико-географические барьеры, в том числе русла крупных рек, являются одними из основных факторов изоляции популяций, приводящей к их генетической дифференциации и последующему формообразованию. Изучение роли географических факторов в процессе видообразования удобно проводить на видах с большим ареалом, что позволяет оценить вклад географических барьеров и расстояний между популяциями во внутривидовую дифференциацию. Проект направлен на изучение роли крупных рек как географических барьеров в генетической дифференциации сусликов Евразии (род Spermophilus). Объекты предлагаемых исследований – три политипических вида сусликов, с протяженными ареалами, разделенными крупными реками, текущими в меридиональном направлении: малый суслик (S. pygmaeus) – реки Дон, Волга, Урал, крапчатый суслик (S. suslicus) – Днестр, Днепр, Дон и краснощекий суслик (S. erythrogenys) – Иртыш, Обь. Высокая морфологическая изменчивость всех трех видов послужила основанием выделения большого числа подвидов, а позднее, с выявлением генетического полиморфизма по отдельным маркерам мт- и яДНК, выделением их в различные дробные таксономические категории – группы видов, надвиды, полувиды (алловиды). Для решения вопросов внутривидовой дифференциации модельных видов сусликов и таксономическом статусе спорных форм впервые будет применен метод полногеномного секвенирования (высокопроизводительное секвенирование второго поколения). Геномный анализ, основанный на тысячах однонуклеотидных полиморфизмах (SNPs), позволит выявить уровень изоляции популяций разделенных руслами крупных рек и, вероятно, получить временную реконструкцию процесса аллопатрического формообразования. Полученные результаты предоставят возможность провести моделирование прошлой демографической истории для каждого из видов и анализ филогеографии и пространственного подразделения популяций. Кроме того, изучение внутривидового генетического разнообразия позволит осуществлять научно-обоснованные мероприятия направленные на сохранение угрожаемых видов сусликов в условиях нарушенных ландшафтов степного пояса Евразии.

Цель проекта: изучение роли крупных рек как географических барьеров в генетической дифференциации и формообразования сусликов Евразии (род Spermophilus). Для достижения цели выбраны три модельных вида – крапчатый, малый и краснощекий суслики, с ареалами разделенными крупными реками.

Задачи проекта:
1. Подготовить библиотеки методом MIG-seq с использованием выборок образцов, покрывающих бОльшую часть ареала каждого вида, их секвенирование на Illumina MiSeq, биоинформационный анализ полученных прочтений и генотипирование по большому числу молекулярно-генетических маркеров – однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs).
2. Охарактеризовать внутривидовую генетическую дифференциацию видов, уровень изоляции разделенных реками популяций, по данным полногеномного SNP генотипирования и анализу отдельных маркеров мтДНК.
3. Филогеографический анализ, реконструкция предкового ареала, локализация возможных рефугиумов и моделирование демографической истории (изменения эффективного размера популяции во времени) для каждого из видов.
4. На основании полученных данных уточнить статус спорных таксонов в составе трех модельных видов.

Ожидаемые результаты проекта: В результате реализации проекта, будут расширены знания по зоологии и эволюционной биологии за счет выяснения механизмов аллопатрического формообразования грызунов открытых пространств. Впервые с использованием полногеномного SNP генотипирования будет изучен эффект водных барьеров на изоляцию и генетическую дифференциацию трех широкоареальных видов сусликов – S. suslicus, S. pygmaeus, S. erythrogenys. Предыдущие исследования “пограничной” роли рек в генетических различиях форм сусликов основывались, в основном, на анализе маркеров мтДНК. Сопоставление новых геномных данных с известными сведениями по мтДНК позволит уточнить территорию вероятного предкового ареала, пути расселения и последующей радиации изучаемых видов. На основании полученных данных будет уточнен статус спорных таксонов. Впервые будет проведен анализ демографической истории трех видов сусликов Евразии, что будет способствовать решению практических вопросов их охраны. Данные планируемого анализа позволят ответить на вопрос, является ли сокращение численности этих видов следствием современной деградации ландшафтов или естественного процесса сокращения ареалов и сохранения видов в очередных рефугиумах.

Достигнутые результаты проекта
В ходе выполнения проекта изучалась роль крупных рек как географических барьеров в генетической дифференциации сусликов Евразии на примере двух политипических широкоареальных видов – краснощекого (Spermophilus erythrogenys) и малого (S. pygmaeus) сусликов.
В восточной части ареала комплекса краснощеких сусликов водным барьером является река Обь. Исследование полноразмерного гена cyt b мтДНК обнаружило значительный уровень генетической дифференциации (p-дистанция 6,4%; net-дистанция 6,2%) между популяциями сусликов, обитающих на левом и правом берегах Оби.
Значения всех показателей генетической изменчивости гена cyt b в 2–4 раза выше у сусликов, обитающих на левом берегу Оби. Для геномного анализа использовались 24 образца: 13 экз. из 7 локалитетов на левом берегу Оби, и 11 экз. из 2 локалитетов на правом. Анализ популяционно-генетической структуры сусликов разных берегов Оби проведен по массиву данных из 260 SNP. UPGMA-дендрограмма и анализ главных компонент (PCA) разделили выборку на две клады, соответствующие берегам Оби. Первоначальный анализ в STRUCTURE также выявил два кластера. Дальнейший иерархический анализ показал подразделение левобережного кластера еще на две группы – равнинные популяции и предгорные. Среднее значение Fst между сусликами разных берегов составило 0,49, что соответствует их значительной дифференциации и практически полному отсутствию потока генов. При подсчете попарных значений Fst между отдельными популяциями наименьший уровень дифференциации обнаружен между равнинными популяциями левого берега (0,07–0,15) и между двумя правобережными популяциями (0,10). Показатели генетического разнообразия по SNP-маркерам выше у левобережных краснощеких сусликов по сравнению с правобережными. Таким образом, анализ митохондриального (cyt b) и ядерных (SNP) маркеров дал сходные результаты, подтвердив роль реки Обь как эффективного географического барьера для изоляции и генетической дифференциации S. erythrogenys. Полученные данные позволяют утверждать, что на правом берегу Оби обитает не номинативный подвид краснощекого суслика, а отдельная не описанная форма вероятно видового ранга.
Протяженный ареал малого суслика разделен тремя крупными реками – Дон, Волга, Урал. Выборка составила 67 образцов тканей сусликов из 20 поселений, расположенных во всех междуречьях крупных рек. Западная часть ареала: междуречье Днепр–Дон - 8 экз. из 3-х локалитетов, Дон–Волга - 21 экз. из 6-ти локалитетов, горный малый суслик S. p. musicus – 3 экз. из 1-го локалитета. Восточная часть ареала: междуречье Волга–Урал - 17 экз. из 4-х локалитетов, к востоку от реки Урал - 18 экз. из 6-ти локалитетов.
ML-анализ митохондриального гена cyt b подтвердил разделение гаплотипов малого суслика на западную (правый берег р. Волги) и восточную (левый берег р. Волги) клады с дистанцией 4,9%. Гаплотипы горного малого суслика оказались внутри западной клады. Суслики с правого и левого берегов р. Дон не образуют отдельных филогрупп в составе западной клады. В восточной части ареала в отдельную субкладу выделяются только суслики левого берега р. Урал. Сеть гаплотипов показала сходные с ML-деревом результаты. Показатели генетической изменчивости в западной группе выше, чем в восточной, за исключением S. p. musicus, для которого характерны ее минимальные значения. Высокий уровень Fst выявлен между популяциями сусликов с разных берегов Волги, а максимальные значения изоляции характерны для S. p. musicus.
Популяционно-генетический анализ проводили по 352 SNP. UPGMA-дендрограмма оказалась в целом сходной с митохондриальным ML-деревом, однако отличалась положением малого горного суслика. Если в ML-дереве S. p. musicus располагался внутри западной клады, то в SNP-анализе занимал в ней базальное положение. Деление общей выборки на три генетических кластера – горные суслики, западные и восточные по отношению к Волге малые суслики – поддержано программой STRUCTURE и PCA-анализом. Средний уровень дифференциации (Fst) между популяциями западной и восточной частей ареала составил 0,31. Наиболее дифференцированным оказался S. p. musicus (0,41 при сравнении с западными и 0,59 с восточными малыми сусликами). Для изучения барьерной роли других крупных рек – Дона в западной части ареала и Урала в восточной – дальнейший анализ проводился отдельно для каждой части ареала. После повторного генотипирования выборок количество выявленных SNP составило в западной части ареала 463, в восточной – 552.
В восточной части ареала STRUCTURE показала оптимальное деление выборки на четыре кластера. Два кластера соответствуют популяциям междуречья Волга–Урал и два территории к востоку от р. Урал. По уровню Fst средняя дифференциация (0,14–0,17) выявлена между географически близкими, не разделенными р. Урал, кластерами. Сильно изолированными (0,35–0,36) оказались популяции малых сусликов Казахского мелкосопочника. Полученные данные указывают на барьерную роль р. Урал, а также позволяют говорить о вероятном влиянии палеореки, протекавшей по тургайской котловине во время плейстоценовых оледенений, на изоляцию крайних восточных популяций.
В западной части ареала выявлена более сложная генетическая структура. Здесь также обнаружено четыре генетических кластера, однако их географическая структурированность выражена слабо и не зависит от речных барьеров. Популяции, расположенные в северной части правобережного ареала, состояли из генетически сходных экземпляров. Южные популяции (Приазовье, Нижняя Волга и Предкавказье) были генетически разнообразными и содержали, в основном, «смешанные» экземпляры. При попарном сравнении кластеров наиболее изолированными оказались суслики Предкавказья (Fst 0,14–0,32), в остальных парах сравнения генетическая изоляция была слабой (0,04–0,11). Показатели генетического разнообразия малых сусликов уменьшались в западной части ареала с юга на север, в восточной – с запада на восток.
Таким образом, геномный анализ показал: 1) малые суслики дифференцируются на два кластера – западный и восточный, границей между которыми является русло Волги; 2) западная часть ареала малого суслика характеризуется, в основном, широтной генетической структурированностью, не зависящей от речного барьера (р. Дон); 3) для восточной части ареала характерна долготная структурированность, с выраженным влиянием рек (Урал и, вероятно, Палео-Тургай) на генетическую дифференциацию; 4) данные генетической изменчивости являются аргументом в пользу гипотезы формирования S. pygmaeus в долговременном Предкавказском рефугиуме и среднеплейстоценового возраста горного малого суслика S. p. musicus.
Сходные результаты анализов данных таргетного секвенирования мтДНК и высокопроизводительного секвенирования с неполным покрытием яДНК свидетельствуют о перспективности данного подхода при изучении вопросов внутри- и межвидовой дифференциации видов сусликов и таксономического статуса спорных форм.

Область применения. Проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы биологии – выяснения механизмов формирования биологического разнообразия и роли в этом процессе географической изоляции на примере сусликов (Spermophilus) – группы эндемичных млекопитающих, распространенных в степных ландшафтах по всему степному поясу Евразии. Комбинированный анализ изменчивости отдельных маркеров мт- и яДНК и данных высокопроизводительного секвенирования, у трех видов сусликов с протяженными и подразделенными крупными реками ареалами, позволит реконструировать историю видов, оценить роль изоляции расстоянием и географическими барьерами, сформулировать таксономические гипотезы и связать эволюцию видов с историческими изменениями в степях Евразии, что является очередным шагом познания эволюционных изменений, сопровождающих процесс видообразования.